Han ble født i Grue i Solør, men fikk det meste av sin oppvekst i Salten i Nordland, hvor faren var sorenskriver. Nils gikk i første omgang i farens fotspor og avla juridisk embetseksamen 1866. Etter å ha arbeidet en tid som fullmektig hos faren, flyttet han tilbake til Christiania, hvor han fra 1870 bestyrte et luthersk-christelig skolehjem på Valle gård. I denne tiden bestemte han seg for å bli prest, og avla teologisk embetseksamen 1877. 1872 hadde han giftet seg med Thrina Thurmann, og de to kom som prestefolk til Norddal på Sunnmøre 1879.
Nils Astrups foreldre tilhørte den konservative, embetsorienterte fløy av den norske misjonsbevegelse på 1800-tallet. De sluttet opp om misjonsbiskop Hans P. S. Schreuder etter at han hadde brutt med Det Norske Misjonsselskap 1872, og dannet organisasjonen Den Norske Kirkes Misjon ved Schreuder (NKMS). Nils og Thrina Astrup delte denne interessen, og da Schreuder døde 1882, meldte de seg til tjeneste som misjonærer for å fortsette Schreuders arbeid. Nils Astrup tiltrådte som misjonsprest i KwaZulu og leder av NKMS 1883, en tjeneste han stod i til sin død 1919.